VEGF和Smad7雙基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建
摘要：目的:構(gòu)建過(guò)表達(dá)VEGF和Smad7雙基因的慢病毒載體,為勃起功能障礙基因治療的研究提供有效工具。方法:根據(jù)GenBank中基因信息,設(shè)計(jì)合成VEGF和Smad7引物,采用overlap PCR方法擴(kuò)增目的基因片段,運(yùn)用基因重組技術(shù)將其克隆至慢病毒表達(dá)載體Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin,經(jīng)酶切、測(cè)序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。將重組質(zhì)粒和Helper1.0、pHelper2.0輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝雙基因過(guò)表達(dá)慢病毒并測(cè)試其滴度。結(jié)果:經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定表明VEGF和Smad7雙基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功,熒光法測(cè)定重組慢病毒滴度高(2E+8TU/mL)。VEGF和Smad7重組慢病毒能高效轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western blot檢測(cè)顯示VEGF和Smad7蛋白在靶細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶VEGF和Smad7基因并能正確表達(dá)的高滴度的重組慢病毒載體。
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