摘要：在構建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表達載體的過程中,因為表達載體可供選擇的多克隆位點較少,且有些還與目的基因同源,所以采用轉移PCR(T-PCR)擴增技術替代通常的酶切連接方法。為避免錯誤連接或未連接的第一輪T-PCR中間產物對退火溫度不同的第二輪擴增循環產生干擾,本研究對T-PCR接頭引物3′-端和5′-端的兩段序列及其退火溫度、引物、供體質粒和目標質粒模板的濃度,特別是溫度循環程序進行設計和篩選,并用擴增構建的重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞,篩選陽性克隆,進行菌液PCR和測序驗證。結果表明,在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差不大的情況下,T-PCR第一輪擴增的退火溫度以低于或接近其中較低的理論退火溫度為宜。但在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差較大的情況下,則應高于其中較低的理論退火溫度。T-PCR第二輪擴增的退火溫度,適當低于兩條引物理論退火溫度的平均值。按優化的溫度循環程序,從供體質粒pMD19-T擴增ZmSnRK2基因家族8個成員的編碼序列,并整合到目標載體pHBT95啟動子下游特異位點,重組率達60%以上。綜上表明,T-PCR對沒有適用多克隆位點的載體構建的實用性較強。本研究通過優化的溫度循環程序為表達或誘變載體構建提供了一定的理論參考。