時間：2023-06-15 17:17:47
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【摘要】
目的建立骨康口服液中有效成分的含量測定方法。方法采用HPLC法測定骨康口服液中有效成分含量。結果補骨脂素和異補骨脂素兩種成分均達到良好分離，在測定范圍內線性良好，回收率均在99%～101%之間。結論所建立的定量方法簡便可行、重復性好，可作為骨康口服液的質量監控。
【關鍵詞】 骨康口服液 補骨脂素 異補骨脂素 高效液相色譜法
Abstract:ObjectiveTo establish a method of HPLC for determining psoralen and isopsoralen in Gukang Oral Liquid. MethodsThe effective components in Gukang Oral Liquid were determined by HPLC. ResultsThe resolution and the linearity were fine with the rate of recovery of psoralen 99.96%，RSD＝1.16%; the recovery rate of isopsoralen was 100.09%，RSD=0.60%.ConclusionThe quantitative method for determining the ingredients of Gukang Oral Liquid is simple， feasible and repeatable， and can be used for quality control of Gukang Oral Liquid.
Key words:Gukang Oral Liquid; Psoralen; Isopsoralen; HPLC
骨康口服液由補骨脂、羊藿、肉蓯蓉、白芍、黃芪等10味藥材組成，具有補腎壯骨，活血通絡，健脾益氣的功效， 臨床上主要用于治療婦女更年期引起的骨質疏松癥。骨康口服液復方共煎，有利于補骨脂素與異補骨脂素的煎出［1，2］，故采用水提醇沉工藝制備［3］。鑒于補骨脂素、異補骨脂素可相互轉化［4，2］，原標準采用TLCS法測定補骨脂素、異補骨脂素兩者的總量［5］。但TLCS法變異大，故選用HPLC法同時測定骨康口服液中補骨脂素與異補骨脂素的含量。現將研究結果報道如下：
1 儀器與試藥
DIONEX SUMMIT高效液相色譜儀（PDA-100檢測器、STH585柱溫箱、P680 HPLC泵、ASI-100自動進樣器），Chromeleon色譜工作站；補骨脂素（供含量測定用，110739-200309）、異補骨脂素(供含量測定用，110738-200410)，均由中國藥品生物制品檢定所提供；骨康口服液（批號：20061009，20061012，20061015），由廣州中醫藥大學新藥開發研究中心提供；乙腈為色譜純（Merck，1192230）其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件
色譜柱：Phenomenex luna C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%冰醋酸為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；檢測波長：246 nm；流速：1.0 ml·min-1；柱溫：25℃；進樣量：10 μl；理論塔板數均不低于3 000。
2.2 溶液的制備
2.2.1 對照品溶液的制備
精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品適量，分別置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，以此作為對照品貯備液。精密吸取上述各對照品貯備液適量，加甲醇制成每毫升含補骨脂素35 μg，異補骨脂素44 μg的混合溶液，搖勻即得。
2.2.2 供試品溶液的制備
取本品10支，混勻，精密吸取藥液10 ml，加乙醚提取4次，10 ml/次，分取乙醚層，60℃揮干乙醚， 用甲醇溶解殘渣，并轉移至5 ml容量瓶中，用甲醇加至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。
2.2.3 陰性對照溶液的制備
取處方中除補骨脂外的其余成分制成缺補骨脂陰性對照品，按“2.2.2”項下的供試品制備方法處理得缺補骨脂陰性對照液。
2.3 線性關系考察
精密吸取對照品溶液2，4，6，8，10，14μl進行色譜測定，按上述色譜條件測定峰面積，并以峰面積（Y）對進樣量（X）進行回歸，補骨脂素在70～490 ng范圍內呈良好線性關系，異補骨脂素在88～616ng范圍內呈良好線性關系，回歸方程分別為：補骨脂素：Y=8224.5X-48.132 6， r=0.999 9；異補骨脂素：Y=7 371.7X-52.475 2， r=0.999 9。
2.4 精密度實驗
精密吸取上述補骨脂素和異補骨脂素對照品溶液10 μl連續進樣5次，測得峰面積積分平均值補骨脂素為3 211.929，RSD為0.07%；異補骨脂素為3 676.707，RSD為0.16%，表明分析方法精密度良好。
2.5 重復性實驗
按照擬定的含量測定方法，對同一批樣品（批號：20061009）制備供試品溶液，平行操作6份，結果測得補骨脂素平均含量為0.075 mg·g-1，RSD為2.39%；異補骨脂素平均含量為0.072 mg·g-1，RSD為2.54%，表明本測定方法具有較好的重復性。
2.6 穩定性實驗
精密吸取同一供試品溶液10 μl，在0，2，4，8，12 h分別進樣，記錄峰面積并計算RSD，結果：補骨脂素平均峰面積為1 330.393，RSD為0.46%；異補骨脂素平均峰面積為1 056.411，RSD為1.6%，表明樣品中補骨脂素和異補骨脂素在12 h內穩定。
2.7 專屬性實驗
取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液，按本色譜條件各進樣10 μl。結果見圖1。結果顯示，在本色譜條件下，陰性對照無干擾。
2.8 加樣回收率實驗
精密吸取已知含量的同一批樣品（20061009）10 ml，分別精密加入一定量的補骨脂素對照品和異補骨脂素對照品，按供試品溶液制備方法制備并測定，按公式回收率（P）(%)=(測得量-加入量)/樣品量×100%計算回收率。結果見表2。表明本方法具有良好的回收率。表1 骨康口服液中補骨脂素、異補骨脂素的HPLC測定梯度洗脫條件（略）表2 加樣回收率實驗結果（略）表3 樣品中補骨脂素、異補骨脂素含量測定結果（略）
2.9 樣品測定
取骨康口服液3批，照上述方法處理后測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算樣品中補骨脂素和異補骨脂素的含量。結果見表3。
3 討論
3.1 提取溶媒的選擇
本品處方由多味中藥組成，且由水煎煮濃縮制得，活性成分多，極性強，影響鑒別的干擾因素較多。筆者曾用水直接稀釋樣品進樣分析，結果雜質峰較多，分離效果差。考慮到補骨脂素與異補骨脂素為呋喃香豆素類成分，因此采用乙醚提取。實驗結果表明，該法可使樣品中的補骨脂素與異補骨脂素提取完全。
3.2 流動相的選擇
目前《中國藥典》2005年版和文獻報道中HPLC法測定補骨脂素與異補骨脂素大多采用甲醇-水體系［6～9］，但經過實驗發現，這些體系均不適用于該制劑的分析，本文選用乙腈-0.1%醋酸溶液梯度洗脫，可以同時測定補骨脂素與異補骨脂素的含量，且獲得較好的分離效果，且峰形更佳。本法操作簡便，精密度高，重現性好，是控制骨康口服液內在質量的有效方法。
【參考文獻】
［1］蘇子仁，劉慶思，徐必達，等. 方藥配伍對溫補腎陽方君藥補骨脂素、異補骨脂素煎出的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，1996，2(5):8.
［2］蘇子仁，徐必達，劉慶思，等. 磷脂對骨康方補骨脂素、異補骨脂素煎出增溶作用探討［J］.中國實驗方劑學雜志，1997，3(3):5 .
［3］吳雪茹，蘇子仁，施佳平，等. 骨康口服液工藝優化研究［J］.中成藥，1999，21(5)：218.
［4］蘇子仁，徐必達，劉慶思. 補骨脂素、異補骨脂素在骨康提取精制過程中化學轉化的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，1997，3(6) ：1.
［5］曾惠芳， 蘇子仁， 劉慶思. 骨康口服液中補骨脂素，異補骨脂素的含量測定［J］.中藥新藥與臨床藥理 ，1999，10(4)：237.
［6］國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學工業出版社，2005：129，229，577.
［7］陸 蓓，吳韶銘.HPLC法測定益腎靈顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量［J］.中國藥品標準，2002，3(4):23.
摘要：目的：建立補腎酒中補骨脂素與異補骨脂素的含量測定方法。方法：采用高效液相法，選用Zorbax SB－C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為甲醇－0.01%磷酸(40∶60)；檢測波長246 nm；柱溫40℃。結果：補骨脂素在0.046 9～0.233 1 μg范圍內線性良好，r＝0.999 9；異補骨脂素均在0.046 6～0.232 8 μg范圍內有較好的線性關系，r＝0.999 9；補骨脂素加樣回收率平均為98.44%，RSD為1.19%(n＝5)；異補骨脂素平均回收率為99.70%，RSD為1.99%。結論：該法簡便，快速，可用于補腎酒的質量控制。
關鍵詞：補骨脂素； 異補骨脂素； 補腎酒； 高效液相色譜法
Determination of Psoralen and Isopsoralen in Bushen Wine by High Performance Liquid Chromatography
Abstract:Objective:To establish a method for the determination of psoralen and isopsoralen in Bushen Wine by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods:The Zorbax SB－C18 was used as the stationary phase. The mobile phase consisted of methanol－0.01% phosphatic acid (40∶60) and detective wave was 246 nm.Results:The calibration curves of psoralen and isopsoralen were linear respectively at the range of 0.046 6～0.232 8 μg(r＝0.999 9)， 0.046 6～0.232 8 μg(r＝0.999 9).Conclusion:This method is reliable and accurate， the method can be applied to separate and determine the Bushen Wine.
Key words:Psoralen； Isopsoralen; Bushen Wine; HPLC
補腎酒為新研制的內服純中藥制劑，由補骨脂，黃芪等二十幾味中藥組成，主要用于腎虛氣虧引起的性功能障礙。補骨脂是處方中君藥，其有效組分補骨脂素，異補骨脂素為主要有效組分，在質量標準的研究制訂中，采用高效液相色譜法測定補腎酒中補骨脂的有效成分補骨脂素和異補骨脂素的含量，結果表明實驗的重現性好，準確度高，為補腎酒的質量控制提供了可靠的方法。
1 儀器與試劑
儀器 HP1050高效液相色譜儀。
試劑 甲醇色譜純；磷酸 優級純；對照品:補骨脂素；批號0739－9907，異補骨脂素；批號0738－9907；供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供。
2 方法與結果
2.1 色譜分析條件色譜柱：Zorbax SBC18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動相甲醇0.01%磷酸(40∶60)；柱溫為40℃；檢測波長246 nm；流速1.0 ml/min。
2.2 供試品溶液的制備精密量取裝量項下的本品10 ml，濃縮至約4 ml，加水10 ml，混勻，用乙醚振搖提取4次(20，15，15，15 ml)，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇適量使溶解，并定量轉移至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，通過已處理好的中性氧化鋁柱(100～200目，2 g，內徑1.0 cm)上，收集藥液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，即得。
2.3 對照品溶液的制備精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品，加甲醇溶解，制成每毫升中含補骨脂素、異補骨脂素各10 μg的溶液，即得。
2.4 空白實驗按處方中藥味的比例，自配不含補骨脂的群藥，按其工藝制成空白制劑，再按供試品溶液制備方法制備并測定，結果空白溶液與補骨脂素與異補骨脂素對照相同保留時間處未顯色譜峰，認為無干擾(見圖1)。
2.5 線性關系考察分別精密量取補骨脂素對照品的甲醇溶液(0.117 1 mg/ml)、異補骨脂素對照品的甲醇溶液(0.116 4 mg/ml)各1，2，3，4，5 ml，分別置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以補骨脂素、異補骨脂素對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果表明補骨脂素在0.046 9～0.233 1 μg范圍內線性良好，其回歸方程為Y＝74 768.04X100.40，r＝0.999 9，異補骨脂素在0.046 6～0.232 8 μg范圍內線性良好，其回歸方程為Y＝74 939.86X＋243.40，r＝0.999 9。
轉貼于
2.6 樣品溶液的穩定性實驗精密量取同一供試品溶液(批號040106)，進樣10 μl，分別于配制后0，2，4，8，17，26 h，依法測定，結果表明，在26 h內基本穩定，補骨脂素RSD為1.16%，異補骨脂素RSD為1.70%。
a對照品 b樣品 c色譜圖
1.補骨脂素 2.異補骨脂素
圖1 色譜圖（略）
2.7 精密度實驗精密量取同一供試品溶液(批號040106)，進樣10 μl，重復進樣5次，求得相對標準偏差RSD為0.42%，異補骨脂素相對標準偏差RSD為0.39%。
2.8 重復性實驗按正文方法，對同一批號(批號為040106)樣品5份進行測定，求得補骨脂素平均含量0.013 6 mg/ml，相對標準偏差RSD為1.98%；異補骨脂素平均含量0.014 1 mg/ml，相對標準偏差RSD為1.63%。
2.9 回收率實驗采用加樣回收法，精密量取已知含量的同一批號樣品(批號040106，含量補骨脂素為0.013 6 mg/ml，異補骨脂素為0.014 1 mg/ml)5 ml，精密加入補骨脂素對照品、異補骨脂素對照品適量，按正文供試品溶液的制備方法制備及上述色譜條件測定，結果見表1～3。
表1 補骨脂素回收率（略）
表2 補骨脂素回收率（略）
2.10 樣品測定按正文方法，測定十批樣品，結果見下表。
表3 樣品中補骨脂素與異補骨脂素含量測定結果（略）
3 討論
3.1 流動相的確定曾采用甲醇水(80∶20)，(70∶30)，(60∶40)，補骨脂素與異補骨脂素峰為一個峰，無法分離，采用甲醇－水(40∶60)，可將二峰分離，但有拖尾現象，加入少量磷酸，以甲醇0.01%磷酸(40∶60)為流動相，分離效果好，且無拖尾現象。
3.2 本實驗采用HPLC法測定補腎酒中補骨脂素與異補骨脂素的含量，其提取方法簡單，分析快速，精密度高，重現性好，且空白無干擾。
參考文獻
［1］ 國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學工業出版社，2000：411411.
【摘要】 目的建立一種測定溫胃舒片中補骨脂素和異補骨脂素含量的反相高效液相法。方法采用Kromasil C18柱，以甲醇水(55∶45)為流動相，紫外檢測波長246 nm，流速1 ml·min-1。結果在所使用的色譜條件下，補骨脂素和異補骨脂素出峰位置未見干擾，補骨脂素和異補骨脂素分別在5.06～30.36 μg·ml-1和5.02～30.12 μg·ml-1濃度范圍內線性關系良好(r=0.999 9)。溫胃舒片中補骨脂素和異補骨脂素的平均加樣回收率分別為97.64%和99.42%，相對標準偏差分別為1.16% (n=6)和0.86% (n=6)。結論該法可信度高，操作簡便，重現性好，可用于溫胃舒片生產上的質量控制。
【關鍵詞】 溫胃舒片； 補骨脂素； 異補骨脂素； 反相高效液相法； 定量分析
Determination of the Contents of Psoralen and Isopsoralen Contained in Wenweishu Tablet by RPHPLC
Abstract:ObjectiveTo establish a RPHPLC method for determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen contained in Wenweishu Tablet. MethodsThe analysis was carried out by using a Kromasil C18 analytical column with methanol-water (55∶45， v/v) as mobile phase. The UV detection wavelength was 246 nm and the flow rate was 1 ml·min-1.ResultsUnder the chromatographic conditions used， there were no interferences found in the positions of Psoralen peak and Isopsoralen peak. Psoralen and Isopsoralen had fine linear responses (r=0.999 9) in the concentration ranges of 5.06～30.36 μg·ml-1 and 5.02～30.12μg·ml-1 respectively， the average recoveries of Psoralen and Isopsoralen in Wenweishu Tablet were 97.64% with the relative standard deviation of 1.16% (n=6) and 99.42% with the relative standard deviation of 0.86% (n=6) respectively. ConclusionThe method employed in this analysis is reliable and convenient with good repetition and can be used for quality control in the production of Wenweishu tablet.
Key wordsWenweishu Tablet； Psoralen； Isopsoralen； RP-HPLC； Quantitative Analysis
Wenweishu Tablet is a pure formulated preparation of traditional Chinese medicine made of twelve crude herbal materials Radix Codonopsis， Radix Aconiti Lateralis Preparata， Radix Astragali Preparata， Cortex Cinnamomi， Rhizoma Dioscoreae， Herba Cistanches， Rhizoma Atractylodis Macrocephalae， Fructus Crataegi， Fructus Mume， Fructus Amomi， Pericarpium Citri Reticulatae and Fructus Psoraleae by the method of boiling with water， concentration， dry granulation， tabletting and coating. Wenweishu Tablet has the following functions: strengthening healthy "qi"， warming and nourishing stomach，promoting "qi" circulation to relieve pain. It can mainly be used to treat patients and symptoms for chronic atrophic gastritis and gastric abscess， abdominal distension， belching， anorexia， chilly， acratia etc. caused by chronic gastritis in clinical application. Psoralen and Isopsoralen are the major active constituents of Fructus Psoraleae and also the main effective contents in Wenweishu Tablet. The Pharmacopoeia of China requires the total content of Psoralen and Isopsoralen in Fructus Psoraleae to be no less than 0.7%［1］. Psoralen and Isopsoralen are furocoumarin compounds and have been reported to have anti-tumor activity against BGC823 cancer cell by Morphological and MTT assays in vitro［2］. The chemical structures of Psoralen and Isopsoralen are shown in Figure 1.
For determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen， the major analytical methods reported in the literatures are UV-spectrophotometry， TLCScanning， GC， CGC， SFECGC and HPLC［3～8］. Since HPLC has the advantage of convenient and good repetition， thus in the study of quality control of Wenweishu Tablet， we choose the indexes of Psoralen and Isopsoralen as quality control criteria and establish a RP-HPLC method for determining the contents of Psoralen and Isopsoralen in Wenweishu Tablet. The analytical results are satisfying and will provide a quantitative evaluation for quality control in the production of Wenweishu Tablet.
Fig 1 The chemical structures of Psoralen (A) and Isopsoralen (B)（略）
1 Apparatus and chemicals
Chromatographic analysis was performed on a 2690 Separations Module high performance liquid chromatograph (Waters， USA) equipped with a 996 Photodiode Array detector and connected to a Millennium 32 data processing system. A Model BP211D electronic balance (Sartorius， Germany) was used for weighing samples.
Psoralen (Batch number: 110709200310) and Isopsoralen (Batch number: 110738200309) were supplied from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Beijing， P.R. China) and their purities were 99.37% and 99.36% respectively by the identification from RP-HPLC. Wenweishu Tablet (Batch number: 050323， 050324， 050325， 050326， 050329， 050330， 050331， 050406， 050407， 050408) was supplied from Zhejiang Yixin Pharmaceutical Co.， Ltd. The reagent used for the preparation and for the RP-HPLC analysis was of chromatographic grade (methanol). The water used for the preparation and for the RP-HPLC analysis was freshly deionized and redistilled.
2 Experimental methods and results
2.1 Chromatographic conditions and systematic compatibility testSeparations were obtained on a Kromasil C18 analytical column（250 mm×4.6 mm，φ5 μm）(Dalian chemical and physical Institute of China Academy of Science， P.R. China) with methanolwater (55∶45， v/v) as mobile phase. The UV detection wavelength was 246 nm and the flow rate was 1 ml·min-1. The column temperature was 30℃ and injection volume was 10μl. Under the chromatographic conditions used， the number of theoretical plates calculated on the peak of Psoralen was 4341 and there was a complete baseline separation among Psoralen， Isopsoralen and other components with a good degree of resolution (Rs = 2.26).
2.2 The preparation of standard solution， sample solution and blank solution
2.2.1 The preparation of standard solution The suitable amounts of Psoralen and Isopsoralen were accurately weighed and dispersed together in methanol， mixed， a 20 μg per milliliter mixing standard solution was obtained.
2.2.2 The preparation of sample solution About 1 g of the sample (comminuted powder) was accurately weighed and dispersed in 20ml of methanol， extracted ultrasonically for 30min. After cooling， methanol was added to this mixture till the total volume 25ml， mixed， the filtrate was obtained as a sample solution by filtration.
2.2.3 The preparation of blank solutionAccording to the proportion of prescription， other crude herbal materials in the prescription were weighed in the suitable amounts except Fructus Psoraleae. Using preparation technology of Wenweishu Tablet and preparation method of sample solution， a blank solution was obtained.
2.3 Interference test of blank solution10μl of standard solution， sample solution and blank solution were injected respectively into the RP-HPLC column under the chromatographic conditions described above. The results (Figure 2) showed that there were the same peaks of Psoralen and Isopsoralen appeared in the same retention times between standard solution and sample solution， whereas there were no peaks of Psoralen and Isopsoralen appeared in these retention times in blank solution， thus there were no interferences for the determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen in sample solution.
(A) chromatogram of the standard solution
(B) chromatogram of the sample solution (C) chromatogram of the blank solution
Fig 2 Typical chromatograms for the determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen（略）
2.4 Determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen in Wenweishu Tablet
2.4.1 Calibration curve and linear rangeAbout 5.06mg of Psoralen and 5.02 mg of Isopsoralen were accurately weighed and dispersed together in 100ml of methanol， mixed， a 50.60μg per milliliter and 50.20 μg per milliliter mixing standard stock solution was obtained. Then 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml of this mixing standard stock solution were taken respectively in six 10ml volumetric flasks， diluted with methanol to a constant-volume of 10 ml， mixed， a series of standard solutions were obtained. Under the chromatographic conditions described above， 10μl of each standard solution was taken for measuring and the chromatograms were recorded. After regression analysis of linearity， the calibration curves were described by regression equations A1=7126 2C1-3828 (r=0.999 9， for Psoralen) and A2=71 840C2-17 823 (r=0.999 9， for Isopsoralen)， where A1 and A2 were the peak areas of Psoralen and Isopsoralen (as longitudinal coordinate)， C1 and C2 were the concentrations of Psoralen and Isopsoralen (as horizontal coordinate)， and r was the correlation coefficient. The results showed that the peak area of Psoralen (Isopsoralen) and the concentration of psoralen (Isopsoralen) had fine linear responses in the concentration range of 5.06～30.36 μg·ml-1 (5.02～30.12 μg·ml-1).
2.4.2 Chromatographic test of precision10μl of a same concentration of Psoralen and Isopsoralen mixing standard solution was taken to continuously analyze for six times， the RSD of peak area of Psoralen (Isopsoralen) was 0.27% (0.62%). The results showed that the chromatographic method was quite precise.
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2.4.3 Chromatographic test of stabilityAccording to the method for the determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen， a sample of the same batch number was accurately weighed and the sample solution was prepared， and 10 μl of this solution was measured in 0， 2， 4， 6， 8， 10， 12 h within a day， the RSD of peak area of Psoralen (Isopsoralen) was 0.33% (0.49%). The results showed that the sample solution was stable within 12 h.
2.4.4 Chromatographic test of reproducibilitySix of 1g of sample (comminuted powder， Batch number: 050407) were accurately weighed， and the contents of Psoralen and Isopsoralen were determined after treated like the method of determination of the contents of samples， the average content of Psoralen (Isopsoralen) was 0.166 mg·tablet-1 (0.319 mg·tablet-1)， and the RSD was 1.39% (1.67%). The results showed that the chromatographic method had a good reproducibility.
2.4.5 Recovery of the chromatographic methodSix of 0.5g of samples (comminuted powder， Batch number: 050407) were accurately weighed and put into six of 25ml volumetric flasks respectively. Then two of 4， 5， 6 ml of the mixing standard stock solution of Psoralen (30.40 μg per milliliter) and Isopsoralen (63.60 μg per milliliter) and two of 16， 15， 14 ml of methanol were added respectively， extracted ultrasonically for 30 min. After cooling， these mixtures were diluted with methanol to a constant-volume of 25ml， mixed， the filtrates were obtained by filtration， 10μl of each filtrate was taken for measuring and the recovery was calculated， the average recovery of Psoralen (Isopsoralen) was 97.64% (99.42%) and the RSD was 1.16% (0.86%) (n=6). The results were shown in Table 1 and Table 2.
Tab 1 Recovery test of Psoralen（略）
Tab 2 Recovery test of Isopsoralen （略）
2.4.6 Determination of the contents of samplesThree of 1g of samples (comminuted powder， Batch number: 050323， 050324， 050325， 050326， 050329， 050330， 050331， 050406， 050407， 050408) were accurately weighed， and treated like the item “2.2.2”， thirty of sample solutions were obtained. 10μl of each sample solution was taken for measuring and the contents of Psoralen and Isopsoralen were calculated based on each calibration curve. The results were shown in Table 3.
Tab 3 Result of sample analysis （略）
3 Discussion
3.1 Selection of detection wavelengthThe UV spectrum showed that Psoralen and Isopsoralen had obvious absorbent peaks at the wavelength 244 nm and 245 nm respectively after UV-scanning via a 996 Photodiode Array detector， thus 246 nm was selected as detection wavelength.
3.2 Selection of the methods of sample pre-treatmentThe experiments investigated three kinds of extraction methods - ultrasonic extraction， refluxing extraction and Soxhlet's extraction. The results showed that the sample solution treated by ultrasonic extraction had minimum impurities that disturbed the determination of the contents of Psoralen and Isopsoralen， and the effect of extraction was the best. On further investigation to the time of ultrasonic extraction， we found that Psoralen and Isopsoralen could be extracted at the maximum after the sample being extracted ultrasonically for 30 min. In addition， the experiments compared the effect of different extraction solvents (methanol， ethanol， chloroform， mobile phase and redistilled water) and different number of extractions on the results， which revealed that methanol as extraction solvent would give better separation effect and Psoralen and Isopsoralen would be extracted completely from the sample only one time.
3.3 Comparison of the methods of the content determinationWenweishu tablet is a product derived from Wenweishu capsule with dosage form changed. The criterion for content determination of Wenweishu capsule is not sufficient since only TLC-scanning is used to determine the content of Psoralen in the course of quality control (WS3-B-2629-97). However， in the study of quality control of Wenweishu Tablet， we chose indexes of Psoralen and Isopsoralen as quality control criteria and adopted RP-HPLC method for determining both contents at the same time. After examination of methodology， the established method satisfies the requirements of content determination and is convenient， and the results are reliable with good repetition.
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關鍵詞 白癜風顆粒 補骨脂素 異補骨脂素 高效液相色譜法
白癜風是一種皮膚色素脫失、呈現白色斑的皮膚病。據統計，我國約有3000萬的白癜風患者。中醫理論認為，白癜風雖長在外表，根卻在臟腑。系因于情志不舒、氣血不和、脈絡阻滯不通、毛孔閉塞、肌膚失養所致。
白癜風的病因:主要是臟腑失和,肝郁失疏,血熱、外受風溫、濕熱之邪停留在肌膚,導致氣血失調,血不營養肌膚和七情內傷,風邪搏于肌表,日久濕熱內蘊,阻遏氣血津液在人體正常分布流通,促使肝腎不足,肌膚失養,毛竅因子閉塞死亡,氣滯則形成白癜風。其病因與遺傳,免疫功能異常,內分泌代謝功能紊亂,黑色素細胞自身破壞,氨酸、銅離子缺乏,精神緊張,微循環障礙,神經調節功能異常,外傷,化學物質、烈日曝曬等有密切聯系。
中藥白癜風顆粒臨床上治療白癜風的效果比較好。白癜風顆粒由補骨脂、黃芪、紅花、當歸、川芎等15味中藥組成。具有益氣行滯、活血解毒、利濕消斑，驅風止癢之功效，在本院皮膚科應用多年，證實對白癜風等疾病有效。為了控制白癜風顆粒的質量，保證臨床用藥效果，本實驗建立了HPLC測定白癜風顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的方法。經方法學考察證實該方法特異性高，回收率和精密度好，結果滿意。
儀器與試劑
Waters 600高效液相色譜儀；Waters[LL] 2487紫外、可見波長檢測器；Breeze色譜工作站；十萬分之一微量分析天平；補骨脂素對照品(110730-200309)和異補骨脂素對照品(0738-200108)購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純，白癜風顆粒由本院自制。
方法與結果
色譜條件1～2：色譜柱,ReliaSil．C18(4．6mm×250mm，5μm)；流動相：甲醇,水(47：53)；流速,1.0ml/min；檢測波長,245nm；柱溫室溫，進樣量μl。對照品溶液的制備：精密稱取補骨脂素對照品10．42mg，異補骨脂素10．92mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1．5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
供試品溶液的制備：取本品粉末約0．5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
陰性對照品溶液的制備：按處方制備取不含補骨脂藥材的樣品顆粒劑，按供試品溶液的制備方法制成相應的陰性樣品溶液。線性關系考察：精密吸取補骨脂素與異補骨脂素混合對照品溶液2、4、6、8、10μl分別注入液相色譜儀，測定補骨脂素與異補骨脂素色譜峰面積。以補骨脂素與異補骨脂素的進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y=1．25×103+7．55×106x，r=0．9997。
結果表明，補骨脂素在0．031264~15630 μg具有良好的線性關系，異補骨脂素在0．03276~0．16380 μg具有良好的線性關系。
精密度實驗：精密吸取同一供試品溶液(批號：050502)5μL，重復進樣6次，分別計算補骨脂素和異補骨脂素的質量分數，結果其RSD分別為0．76％和1．29％。
穩定性試驗：精密吸取對照品溶液5μL，分別于0、2、4、24、36小時測定峰面積，計算得補骨脂素和異補骨脂素峰面積的RSD分別為1．99％和1．62％，表明對照品補骨脂素和異補骨脂素在36小時穩定。
重現性實驗：取樣品，精密稱定5份，制備供試品溶液，進樣測定計算補骨脂素和異補骨脂素的質量分數，其RSD為0．59％。
回收率實驗：采用加樣回收法。取批號為050501的樣品5份，每份0．25g，置具塞錐形瓶中，各精密加入補骨脂素和異補骨脂素混合對照品0．14mg，制備供試品溶液，進樣，測定。結果補骨脂素和異補骨脂素平均加樣回收率為99．04％，RSD為1．50％。
樣品測定：取3批白癜風顆粒制備供試品溶液。精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5μL，進樣，測定，結果見表1。根據結果，暫定本品以干燥品計，含補骨脂素和異補骨脂素總含量不得少于0．22mg／g。
討 論
流動相的確定：本實驗曾選擇乙醇-水溶液系統，結果不太理想，補骨脂素和異補骨脂素的出峰區間有干擾，峰形欠佳。而采用本實驗的色譜條件即甲醇-水系統，補骨脂素和異補骨脂素的峰形得到明顯的改善，且干擾減少 。
參考文獻
【關鍵詞】 補骨脂酊 補骨脂素 補骨脂素 反相高效液相色譜法
Abstract:Objective An RP-HPLC method was established for determination of psoralen and isopsoralen in Buguzhi tincture.Methods The XTerra RP18 (4.6 mm×250 mm，5 μm) was used. The mobile phase consisted of acetonitrile-water (0.28∶0.52). The detection wave length was 247 nm.Results The retention time of psoralen and isopsoralen angelicin was 14.326 min and 15.259 min respectively. The calibration range of psoralen was 0.88～14.08 mg·L-1. (r=0.9998) and that of isopsoralen was 0.80～12.80 mg·L-1（r=0.9999）; the average recovery was 99.5％（RSD=1.10％） and 100.4％（RSD=0.59％） respectively.Conclusion The method， being simple， rapid and accurate， can be used to examine the quality of Buguzhi tincture.
Key words: Buguzhi tincture； psoralen； isopsoralen； RP-HPLC
補骨脂酊是中藥補骨脂通過提取制成的酊劑，其含有補骨脂素(psoralen)、異補骨脂素(isopsoralen)等有效成分，有鎮靜、解痙、抗癌和光敏等作用［1］。其有效成分能在黑色素細胞中濃集，在紫外線的作用下，能增加酪氨酸酶的活性，從而增加色素的生物合成能力，用于治療白癜風［2］。補骨脂的有效成分測定方法有雙波長薄層掃描法［3］、高效液相色譜法［4-5］等。補骨脂酊是我院使用多年的中藥制劑，僅有定性鑒別，而無定量測定方法。本實驗建立反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定其有效成分，方法簡便，結果較滿意，可作為補骨脂酊的質量控制。
1 儀器和試藥
1.1 儀器 美國Waters高效液相色譜儀（包括1525二元高壓梯度泵、717自動進樣器、2487雙波長檢測器）；BP 618型電子分析天平（德國）；KS-80D型超聲清洗機（寧波海曙科生超聲設備有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）。
1.2 試藥 補骨脂素中藥化學對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110739－200511）；異補骨脂素中藥化學對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110738－200309）；補骨脂酊為本院制備，甲醇、乙腈為色譜純。
2 方法和結果
2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XTerra RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈－水（0.28∶0.52），流速為0.8 ml·min-1；，檢測波長為247 nm；靈敏度為2.000AUFS；柱溫為35℃；進樣量10 μl。理論板數按補骨脂素峰計算應不低于14000，補骨脂素和異補骨脂素的分離度R大于1.8。
2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品補骨脂素和異補骨脂素約20 mg ，各置50 ml容量瓶中， 加入甲醇溶解并定容至50 ml，渦旋2 min，即得每1 ml中含補骨脂素0.44 mg和異補骨脂素0.40 mg的儲備液，各吸取適量儲備液混合稀釋。
2.3 供試品溶液的制備 精密量取補骨脂酊1 ml，置50 ml容量瓶中， 加乙腈至刻度， 搖勻，作為供試品溶液。同法制備不含補骨脂素和異補骨脂素的空白樣品溶液。 轉貼于
2.4 HPLC方法專屬性 分別取對照品溶液、供試品溶液、空白樣品溶液適量進樣。對照品溶液和供試品溶液中補骨脂素和異補骨脂素組分完全分離， 分離度R大于1.8，保留時間分別為14.326 min和15.259 min，無雜峰干擾測定。空白樣品溶液在補骨脂素和異補骨脂素色譜位置處無吸收峰。見圖1。
2.5 標準曲線的繪制 分別精密吸取0.44 g·L-1補骨脂素和0.40 g·L-1異補骨脂素的對照品溶液20 μl、40 μl、80 μl、160 μl、320 μl，放入同一10 ml容量瓶中，用乙腈分別稀釋至刻度，取10 μl進樣，以濃度（C）對應峰面積（A）進行線性回歸。補骨脂素和異補骨脂素的回歸方程如下。
補骨脂素：A1=－15426+102653C1，r＝0.9998，n＝5。
異補骨脂：A2=－6963+98991C2， r＝0.9999，n＝5。
結果表明：補骨脂素濃度在0.88～14.08 mg·L-1范圍內，異補骨脂素濃度在0.80～12.80 mg·L-1范圍內線性關系良好。圖1 高效液相色譜圖
峰1.補骨脂素；峰2.異補骨脂素
2.6 精密度實驗 分別精密吸取補骨脂素和異補骨脂素的對照品溶液適量， 放入同一容量瓶并用乙腈稀釋至刻度，按“2.1色譜條件”重復進樣5次， 根據測定結果計算，濃度3.52 mg·L-1和14.08 mg·L-1補骨脂素的RSD分別為0.68％和0.46％；濃度3.20 mg·L-1和12.8 mg·L-1異補骨脂素的RSD分別為0.58％和0.41％。
2.7 穩定性實驗 取同一對照品溶液，按“2.1色譜條件”進樣，分別于0、1、2、4、8、12、24 h各時點進行測定，結果補骨脂素的RSD為1.37％，異補骨脂素的RSD為1.14％，表明樣品溶液在24 h內基本穩定。
2.8 加樣回收率實驗 精密吸取已知含量（批號：080124）的樣品適量，分別加入不同量的對照品溶液， 用乙腈稀釋至刻度，每個濃度稀釋2份進行測定，按“2.1色譜條件”操作，計算補骨脂素和異補骨脂素的回收率， 結果見表1。表1 補骨脂素和異補骨脂素的回收率
2.9 樣品測定 精密吸取供試品溶液各0.1 ml， 用乙腈稀釋至5 ml，按照“2.1色譜條件”各進10 μl，以峰面積帶入回歸方程計算樣品的含量，結果見表2。 表2 樣品中補骨脂素和異補骨脂素的含量
3 討 論
訴訟就是人民法院和有關當事人為解決案件所進行的全部活動。策略，即對策與謀略。訴訟策略是指訴訟當事人在整個訴訟活動中或與訴訟活動相關的活動中的對策與謀略。凡訴訟中的各種對策與謀略都可稱之為訴訟策略，如起訴、應訴、辯論、執行活動中的一些正確決策、方法、技巧等。
訴訟策略的正確與否直接關系到商業銀行合法權益的保護。良好的訴訟策略能夠順利的實現訴訟目的，甚至能夠使案件“起死回生”，“轉敗為勝”，最大限度地減少經濟損失。制定、實施訴訟策略的根本目的在于更好的實現訴訟目標，依法維護自身的合法權益。總之，訴訟策略與案件的關系十分密切。銀行經濟訴訟案件標的額大，對銀行的經營效益有著直接的影響，因此，商業銀行更應重視法律糾紛訴訟案件的訴訟策略，以實現最佳訴訟效果。
二、商業銀行制定法律糾紛訴訟策略的程序
商業銀行制定訴訟策略必須持慎重的態度，不可敷衍塞責，圖一時輕松，而導致全盤皆輸。制定訴訟策略既簡單又復雜，既要研究案情，在依據事實和法律的基礎上做出是非判斷，又要為維護當事人或自身的合法權益獻計獻策。就制定訴訟策略的工作方式而言，它可以用個別調查、個別走訪、查閱卷宗、召開專題研討會或集體討論等方式進行。對于工作方式選擇可以因案而異，總的原則是有利于維護商業銀行的合法權益進行訴訟策略制定。
訴訟策略具有一定的程序。現代謀略運籌更具程序化。在辦案過程中，對一些較為簡單的案件，謀略并非必須嚴格地依程序經歷所有階段。但是，在重大、復雜、疑難的案件謀略中，這些階段必不可少，且要依據一定的程序，才能形成高明的謀略。商業銀行制定訴訟策略的程序大致可分以下幾個步驟：
1.分析案情，確定訴訟目標
制定策略是為案件處理服務的，熟悉案件是制定策略的前提條件。作為商業銀行的法律顧問，制定或參與制定訴訟策略，首先要全面地把握案情。對法律糾紛的起因、關鍵問題及現狀應準確地掌握，對于法院已經立案的應訴案件要通過閱卷和調查來了解案件的來龍去脈，查明糾紛產生的時間、地點、范圍、程度和性質，掌握涉及案件的全部證據，并對涉案的證據進行認真的審核和記錄，從證據來源、證據內容、取證程序等方面評斷其價值，為制定策略提供必須的基礎和依據，做到“兵來將擋，水來土淹”，能攻能守。對于準備起訴的案件，要認真分析案情發展趨勢，分析被告可能采取的措施，分析隨著案情發展可能出現的不利因素，分析案情發展的最終結果等（有無勝訴可能、能否保障實質性權利的實現），把握案件中當事人的雙方矛盾的焦點或可能產生的主要分歧。通過把握案件，制定訴訟策略，打有把握之仗，做到“訴之能戰，戰之能勝，勝之能得，百訴百勝”。
制定訴訟策略的實質是就一個具體、復雜的案件進行決策的過程。正確的對案件進行決策，其前提就是要對案件的問題進行分析。案件的問題無外乎產生在主觀方面、客觀方面及主、客觀之間的聯系及實踐方面。分析案情在確定訴訟目標過程中占據首要的地位，如果缺乏對案情透徹而中肯的分析，所確定的訴訟目標及訴訟策略就不可能正確。分析案情，就是要在深入調查研究的基礎上，對具體案件中存在的問題進行具體的分析，抓住案件的實質，明確訴訟目的，確定訴訟目標，對具體案件進行定性和定量分析；就是要分析各方訴訟當事人的利弊，分析各方訴訟當事人所舉之證據，分析各方當事人的主要觀點，分析隨著案件發展可能出現的問題，分析案件結局以及案件結局對其他案件和金融工作的影響等等。通過縱向分析，可以由表及里、由淺入深，找到根本性原因；通過橫向分析，從問題發生的多種原因中，找到問題發生的最根本的、最主要的原因。只有在發現問題發生的根本原因和主要原因后，才可找到解決案件的突破口。
通過對案情的詳盡分析，才可以客觀、合理、正確的確定訴訟策略目標。訴訟謀略目標是人員為了解決問題，希望達到的案件處理結果。訴訟策略目標，是方案設計的方向，是判斷策略方案優劣的標準。目標的準確與否，直接關系到訴訟活動的成敗。訴訟策略目標的制訂，必須達到下列檢驗準則：
（1）目標要有的放矢，具有針對性。針對案件中實際存在的問題，切中案件的疑點和要害。
（2）目標要具體。具有衡量目標是否實現的具體的操作內容，能夠量化的目標盡可能明確數量界限，如索賠額、損失數等。對于較抽象的目標，采用目標分解的辦法，把抽象的總目標轉化為便于數量化的子目標。具體的目標還必須有實現的確切期限和有關約束條件。
（3）目標要系統。有的案件問題比較復雜，存在多個目標，這就要求人員從系統性原理出發，著眼整體，全面考慮多個目標的主次、先后等相互關系，確定最高目標與最低目標，建立起層次分明的目標體系。
（4）目標要切實可行。謀略是否可行，取決于實現目標所需要的條件。謀略目標必須建立在現實案件的基礎上，而不能憑空設想，依主觀愿望行事。
（5）目標要符合規范。謀略目標必須符合國家的法律和黨的政策，符合社會主義道德規范，不以損害他人合法權益為代價。這是目標的規范性所要求的。
2.深思熟慮，擬定方案
在訴訟策略目標確定之后，就要解決如何達到目標的問題，即尋求達到訴訟目標的最佳手段和途徑。據此，人員謀略活動進入第二階段——深思熟慮，擬定方案的階段。
（1）訴訟目標分析：有了目標，心中才能有全局。通過對訴訟目標進行全面、深入的分析來考慮訴訟策略，例如明確必須完成訴訟的主要目標，盡可能完成的第二目標，期望完成的第三目標等。對這些目標，還可進行定性和定量衡量，看在現有條件下能否實現，完成某一具體訴訟目標需要的時間，這樣使目標能夠確定得科學、合理、實際。
（2）制定對策方案：在客觀、全面分析案情、分析訴訟目標的基礎上，對每一過程、每一事實、每一證據上存在的問題提出具體、可能的解決方法、方式；對于涉及案件處理的關鍵問題則需要提出多種不同的方案，以備選用。擬定的方案必須具有兩性：一是齊全性。即把所有可能做到的方案全部擬定出來，以免漏掉最佳方案。這是保證選擇最好方案的重要條件。二是排斥性。即擬定出來的方案之間具有原則性的差異并且互相排斥。所謂互相排斥，就是執行了甲方案不能同時執行乙方案。
簡單的案件，可以直接設計幾個備選的謀略。而較為復雜的案件，往往難以直接形成提供選擇的幾個方案。通常可以分兩步走：第一步是輪廓設想；第二是細部設計。輪廓設想階段，人員要從不同的角度、不同的途徑，提出各種各樣可以適用的謀略。這時候提出的各種謀略方案，可能僅僅是一種思路，而不必過多地考慮細節。因為過多考慮細節，倒會束縛人員的思路。充分發揮創新精神，開闊多種思路，是這一階段的主要特點。
輪廓設想時產生的謀略方案，只有經過進一步精心設計之后，才能加以選擇取舍。輪廓設想時可能會產生大量的謀略方案，需要先行初步篩選，淘汰掉一些不可行的方案，而留下幾個比較理想的謀略方案作細致設計。如果說，輪廓設想階段需要的是大膽的創新和豐富的想象，那么，細致設計階段需要的則是實事求是的精神、冷靜的分析和嚴密的論證。細致設計主要包括以下兩方面的工作：一是確定謀略方案的細節，充實方案的具體內容，使得每一方案具體細致可行；二是估計謀略方案執行的結果。通過預測，估計案件各種條件的變化可能，預計出各種條件下謀略方案的結果。既要充分估計謀略方案實施給當事人、委托人帶來的效益或利益，又要估計其可能產生的風險和副作用。
3.分析評估，選擇方案
分析評估、選擇方案，是訴訟策略運籌的關鍵步驟。對方案進行準確的評估和選擇，將制定的策略方案參照類似“決策樹”方式進行優化，在優化方案中選擇符合案情實際、切實可行、行之有效的對策方案，并在選擇過程中對訴訟方案中潛在的問題做進一步分析，制定應變措施，以保證達到訴訟目標。涉及到效益或損失數據還可以用數學模型進行分析、比較，選出最佳對策方案。
分析評估、選擇方案，一是要有合理的評選標準，二是要有科學的評選方法。
評選訴訟策略方案的標準，首先要看其是否能夠實現訴訟策略目標。這是衡量方案優劣的第一條標準，也是最主要的標準，因為訴訟策略的目標就是為了更好地處理案件，維護銀行的合法權益。所以能夠實現訴訟策略目標的方案，應看作是最佳的謀略方案；其次，在同樣實現訴訟策略目標的前提下評選謀略方案時，還應考慮到以下幾個因素：實施的訴訟策略所付出的代價相對比較小；所承擔的風險相對比較小；所產生的副作用相對比較少。
雖然上述幾點是所有方案的共同標準，帶有普遍性，可以作為評選的依據，但是在實施訴訟策略方案的過程中，由于受到案件人或案件本身主客觀條件的限制，很難簡單地確定哪個案件是最優的。有的訴訟策略方案，可能會最大限度地達到處理目標，但是代價大、風險大，有的訴訟策略方案并不能最大限度達到目標，卻代價小、耗時短、風險小。這就需要全面考慮，綜合權衡。既考慮到當事銀行的要求，又考慮成功和失敗的因素和有利不利的因素。我們認為，訴訟策略方案的選擇應以“銀行利益最大化”為標準，在既定風險情況下追求收益最大化，在既定收益情況下追求風險最小化。
準確的選擇方案，還要求有科學的評選方法。評選謀略方案的具體方法，通常有三種類型：（1）經驗判斷法。即人員根據日常的辦案經驗來評選方案。這是比較古老的評選，也是目前常用的辦案方法。人員根據自己的辦案經驗和掌握的材料，權衡案件處理時對當事人的利弊得失，做出選擇，這在一定范圍內和通常情況下是適用的，可以作為評選謀略方案的重要依據。但是，人員的辦案經驗必然有一定的局限性，在辦理新的案件時，不能盲目照搬過去的經驗，哪怕是成功的經驗。（2）數學分析法。許多復雜的案件處理無法依靠經驗直接判斷優劣，特別是那些關系復雜、帶有鏈環性質的法律糾紛案件，需要依靠數學分析方法，計算案件處理的各個環節中，得與失的經濟數量。然而，由于案件涉及的多樣性，特別是刑事、行政案件，有許多無法量化的社會因素，因此人員選擇謀略方案時難以純粹依靠數學分析的方法。（3）試驗法。在時間、環境及其它條件允許的情況下，可以將訴訟策略方案在小范圍內進行試驗，看是否能取得成效，以此作為最后評選確定訴訟策略方案的依據。
4.實施方案，完善策略
訴訟策略方案的實施，是策略運籌的最后一個環節。策略是行動的選擇，行動是策略的執行。在訴訟策略方案實施階段，主要是做好以下四個方面的工作：
（1）編制實施計劃，把謀略步驟具體化。按訴訟程序編制每一程序的謀略實施計劃。同時，還要做好潛在問題的防范分析，預估每個階段甚至下一個階段可能出現的潛在問題，并制定出有關的預防措施和應變對策，將這些措施落實到策略方案的實施計劃中去。
（2）借助適當的方式予以實施。一是借助訴訟程序的推進予以實施；二是通過非訴訟途徑予以實施，如主持非訴訟調解等；三是借助己方當事人的行為實施。通過己方當事人變更原有的法律行為，變更原有的法律關系，達到實施謀略的目的。
（3）進行反饋調節。在施謀過程中，及時發現謀略方案實施中出現的新問題，針對變化情況，及時提出新的謀略方案與謀略目標。
（4）糾正策略偏差。由于案件主、客觀條件的變化，在謀略實施過程中，難免會發生偏差，需要及時修正。世界上只有相對正確的策略，沒有絕對正確的、放之四海而皆準的策略。即使是正確的謀略，也有可能因為案件情勢的變化，需要進行調節與完善，甚至在個別情況下，策略已經實施的情況下，還需要重新立謀施謀。這在訴訟實務中是相當常見的。通過這些調整，對已初步制定的訴訟策略進行效果評估，進一步進行審查、校正，可以進一步完善策略，以防止決策的失誤，導致訴訟不利。
第一，計提專用基金的問題。事業單位計提修購基金、勤工助學基金、獎貸基金時既沒有資金的流出或流失，凈資產也沒有減少，只不過在支出增加的同時增加了事業單位的凈資產。只有在事業單位的專用基金發生耗費時，才會導致資金的流出或損失。由此可知，提取專用基金并沒有發生資金的耗費及損失，也不符合收付實現制的原則，因此不能構成事業單位的支出。
第二，基本建設支出的問題。事業單位會計準則將用于基本建設的支出單獨列出，并明確基本建設支出是指事業單位列入基本建設計劃，用國家建設資金或自籌資金安排的固定資產新建、擴建和改建形成的支出，這主要是由于事業單位作為一個會計主體實行事業單位會計制度和建設單位會計制度兩套賬的原因。然而，事業單位財務規則的支出管理中卻沒有將基本建設支出納入支出范圍，事業單位會計制度只將除財政補助收入以外的資金安排自籌基本建設，其所籌集并轉存建設銀行的資金納入結轉自籌基建支出中進行核算。定義口徑的不一致造成事業單位財務規則、事業單位會計準則和事業單位會計制度的不統一。而從另一方面看，結轉自籌基建是將財政補助收入以外的資金轉存建設銀行，是貨幣資金在不同的賬務體系中循環，并沒有發生資金耗費或損失，不符合確認支出會計要素的定義，并不是真正的支出。
第三，與財政體制改革的有關規定不相符。我國實行新的預算會計制度以來，以公共財政體制框架為目標的財政體制領域進行了一系列改革，包括部門預算、國庫集中收付制度、政府采購及政府收支分類改革。上述財政體制的改革也使事業單位會計制度核算的內容發生了新的變化，原有的會計要素定義及會計記賬基礎面臨新的挑戰。隨著國庫集中收付制度的實施，事業單位預算內的資金支付只是一種額度的減少或者說是虛擬價值的流動，并沒有資金流出或流失。此外，隨著政府采購和國庫集中支付制度的實施，出現了采購環節與付款環節的脫節，出現貨物已經到達但發票賬單還沒有到達或貨款已經支付但貨物尚未到達的情況，在付款方式上也存在一次付款、分期付款、預留保修金等尾款，如果按傳統的支出會計要素定義和收付實現制來確認支出的話，根本無法處理。
第四，接受捐贈資產處理的問題。按照事業單位會計準則規定，其他收入反映事業單位接受捐贈未限定用途的財物。事業單位會計制度規定在接受固定資產捐贈時借記“固定資產”，貸記“固定基金”。筆者認為這樣處理并不完整，因為沒有反映事業單位接受的捐贈收入。此外，高等學校會計制度還規定，高等學校在收到固定資產捐贈時借記有關支出科目，貸記“其他收入――捐贈收入”，同時借記“固定資產”，貸記“固定基金”。這樣處理，雖然使事業單位的接受捐贈的收入完整反映出來，但是支出卻是虛增的，因為并沒有發生資金耗費及損失，不符合支出會計要素的定義。
第五，經營性業務的問題。事業單位會計準則規定，會計核算一般采用收付實現制，但經營性收支業務核算可采用權責發生制。按照財政部對《民間非營利組織會計制度》的解釋，在權責發生制會計下，不存在收付實現制的“支出”這一會計問題，故沒有設置預算會計中的“支出”這一會計要素。但是事業單位由于業務活動的多樣化、復雜化，其經營活動實際上與企業的生產經營業務沒有實質區別，理應將當期經營活動的收支項目進行配比。此外，由于事業單位需要繳納事業單位企業所得稅，如果用現行支出會計要素定義，那么事業單位的納稅調整工作量相當大。
第六，投資虧損問題。事業單位會計制度規定轉讓債券投資以及到期兌付債券本息，按實際收到的金額，實收金額與賬面金額的差額，借記或貸記“其他收入”科目。實際上投資虧損應該屬于事業單位開展其他活動所發生的資金損失，將其沖減“其他收入”是不適當的。
第七，利息支出的問題。事業單位的利息支出只有在實際發生時列為支出，但是在事業單位賬上反映的利息支出采用費用化處理，而在建設單位反映的借款利息卻可以資本化處理，同樣用于固定資產建設的利息因為會計處理的不同導致不同的結果。
第八，固定資產和無形資產的核算問題。事業單位固定資產購置支出在費用化處理的同時增加“固定資產”和“固定基金”，不計提折舊。事業單位固定資產反映事業單位固定資產的初始價值，無法反映事業單位的固定資產凈值，也無法反映受托事業單位的資產保全責任。其弊端是：一是價值背離。固定資產的賬面價值與實際價值隨著時間的推移越來越遠。二是虛增資產。在資產負債表上固定資產按原值反映，沒有體現固定資產的磨損程度，虛增了資產總量。三是成本不完整。事業單位在購置無形資產時，借記“無形資產”，貸記“銀行存款”等科目，不實行內部成本核算的事業單位一次記入“事業支出”，貸記“無形資產”科目，事業單位購入或自行開發的無形資產在投入使用的月份一次性攤銷記入“事業支出”科目，從投入使用的月份起資產負債表無形資產金額為零。但實際情況是無形資產的價值較大，使用期限較長，則會造成嚴重的賬實不符。
